CONSERVAÇÃO IN VITRO E EX SITU E VALORIZAÇÃO DE ENDEMISMOS IBÉRICOS DAS APIACEAE PORTUGUESAS

Ana Cristina Pessoa Tavares dos Santos

Embriogénese somática

Desde os trabalhos pioneiros de Reinert (1958) e Steward et al. (1958) na embriogénese somática da cenoura (Daucus carota subsp. sativus), que a embriogénese somática é aplicada para a propagação de um grande número apiáceas (Brown et al., 1995; Ekiert 2000; Thorpe e Stasolla 2001; Karuppusamy et al., 2007; Tanavat et al., 2011).
Tanto quanto se sabe, os estudos anteriores sobre a cultura in vitro de D. carota foram concretizados por Imani et al. (2001) e Thi e Pleschka (2005). Em ambos os casos, a embriogénese somática foi a técnica utilizada, mas não foram apresentados dados sobre as taxas de regeneração de plantas e aclimatação. Imani et al. (2001) avaliaram o potencial de seis espécies de Daucus e seis subespécies de cenoura para indução de embriogénese somática, concluindo que D. carota subsp. halophilus foi uma das subespécies com maior capacidade para formar embriões somáticos. Estes dados foram obtidos a partir da cultura de explantes do pecíolo utilizando duas etapas, em que calos embriogénicos foram primeiramente induzidos na presença de IAA, enquanto o desenvolvimento do embrião ocorreu em meio sem auxina. Thi e Pleschka (2005) mostraram que a capacidade de várias espécies e subespécies D. carota na embriogénese somática foi fortemente correlacionada com os níveis endógenos de ABA na cultura dos pecíolos. Explantes com menor concentração de ABA endógeno foram os mais eficazes para a indução de embriogénese somática.
Além da organogénse, já referida, Ebrahimie et al. (2007) estudaram também a embriogénese direta em embriões de cominhos (Cuminum cyminum L.). De acordo com Singh e Kumar (2009), a principal diferença entre organogénese e embriogénese tem a ver com o facto de no primeiro processo morfogenético existir uma origem multicelular e a estrutura unipolar ser formada por divisões procambiais, e mantida a ligação com o tecido vascular pré-existente no calo ou no tecido do explante. Na embriogénese, o embrião somático é uma estrutura bipolar que se forma de uma única célula, sem conexão vascular com o explante.
Nos estudos com embriões de cominhos, os autores verificaram que o alto nível de citocinina endógena, juntamente com a sua produção secundária, em resposta à adição exógena de auxina, acelerou a formação de calos e o padrão de regeneração indireto, enquanto que a aplicação exógena de citocininas, como BA, foi suficiente para acionar o padrão direto de regeneração (Ebrahimie et al., 2006, 2007; Tawfik e Mohamed, 2006).
Tal como os cominhos, muitos membros da família das Apiaceae contêm elevados níveis de metabolitos secundários, em particular terpenos, e elevados níveis de hormonas endógenas (Krens et al., 1997). Baseado nesta propriedade têm sido largamente utilizadas como espécie modelo in vitro, como se verifica com a cenoura, enquanto modelo para a o estudo da embriogénese somática (Thomas et al., 1989) e a alcarávia (Carum carvi L.), como um modelo para o estudo do metabolismo secundário (Krens et al., 1997).
No trabalho desenvolvido para o estudo de embriogénese com 2,4-D, foram utilizados diferentes explantes, segmentos de raízes, de folhas e de pecíolo (este só em Daucus), provenientes de sementes germinadas in vitro, sendo os melhores resultados obtidos com segmentos foliares no caso de Distichoselinum e de Seseli, de segmentos de raízes em Angelica e de segmentos peciolares em Daucus.
As condições utilizadas nas nossas experiências foram diferentes das descritas em Daucus spp. por Imani et al. (2001) e Thi e Pleschka (2005), que utilizaram o pecíolo como explante. A indução de embriões somáticos até atingirem o estágio cotiledonar de desenvolvimento ocorreu no meio original, contendo 2,4-D. Este processo, que contempla apenas uma etapa para a indução de embriogénese somática, reduz o tempo de formação e de germinação do embrião somático.
No que diz respeito ao processo de indução de embriogénese, as concentrações testadas não foram as mesmas em cada taxon, mas nas condições ensaiadas a melhor taxa de produção de embriões somáticos foi conseguida utilizando 0,1 mg/L de 2,4-D, nas culturas de Seselie de Angelica e de 1mg/L de 2,4-D nos ensaios com Distichoselinum e com Daucus. Nas condições testadas nos meios de indução com 2,4-D, a presença de concentrações mais elevadas de 2,4-D, não aumentou a produção de embriões somáticos em Angelica, nem em Seseli, nem em Distichoselinum; pelo contrário, as culturas com menor concentração (0,1 mg/L para os dois primeiros taxa) e de 1mg/L para Distichoselinum, apresentaram os melhores resultados​​. Embora o meio base sem hormona não tenha sido testado nos outros taxa, verificou-se em Distichoselimum que a auxina não é absolutamente necessária para a indução da embriogénese somática pois a formação de embriões somáticos também ocorreu em meio base MS. Em Daucus, verificámos que a produção de calo embriogénico era semelhante em segmentos radiculares e foliares e um terceiro explante foi ensaiado, os segmentos peciolares.
Em todos os casos observou-se embriogénese indireta, ocorrendo a formação de um calo, mais ou menos desenvolvido, precedendo a formação de embriões somáticos. A morfologia dos embriões somáticos seguiu o padrão habitual, sendo observado, em todos os taxa, todas as fases (globular, torpedo, cotiledonar), que são morfologicamente semelhantes às da embriogénese zigótica (Vila et al., 2010).
O desenvolvimento do embrião somático foi bastante variável entre os diferentes explantes e até no mesmo explante. A quantidade de embriões formados por explante era, em geral, elevada, sendo em muito casos difícil de contabilizar. Para além disso, verificou-se que os embriões formados por explante apresentavam diferentes fases de desenvolvimento, sendo frequente a germinação precoce. Ambos os parâmetros, quantidade de embriões formados e sincronismo do estádio de desenvolvimento, são essenciais para melhorar as taxas de regeneração de plantas e a eficácia do processo (Canhoto et al., 2005. Na tentativa de avaliar a capacidade embriogenética de Daucus e Seseli, os dois taxa em que essa produção foi maior e se tornava também por isso difícil determinar o potencial embriogénico dos explantes, procedeu-se a uma estimativa da quantificação de embriões, à semelhança de outros autores (Becwar et al., 1987). Utilizando como explante porções de pecíolos de Daucus, explante já utilizado por outros autores (Imani et al., 2001; Thi e Pleschka 2005), com base no peso dos calos embriogénicos verificou-se que 1 g de calo embriogénico produziu 32 plantas para envasamento. Tal como se observou nos resultados de formação de rebentos caulinares pela cultura de ápices caulinares, também na embriogénese os resultados encontrados para Seseli foram muito próximos dos de Daucus, sendo quantificados em Seseli 28 plantas a partir de uma amostra calosa embriogénica.
Em Angelica sinensis, uma planta medicinal muito interessante e utilizada na China como analgésico, ansiolítico e estimuladora da circulação sanguínea (Tsay e Huang, 1998; Nalawade et al. 2003; Agnnihotri et al. 2004; Chen et al. 2004) a embriogénese foi conseguida em 1998 utilizando 2,4-D (0,5 a 1 mg/L) em células derivadas de embriões imaturos cultivadas em suspensões (Tsay e Huang 1998; Eeva et al., 2003). Nos nossos resultados, os calos embriogénicos de Angelica foram produzidos em maior quantidade a partir das porções radiculares em 0,1 mg/L 2,4-D, e puderam ser mantidos in vitro mais de um ano, após repicagens mensais para meio de igual constituição. Estes embriões germinaram em meio base embora se observasse a produção de novas massas calosas e de novos embriões somáticos neste meio sem 2,4-D. Resultados de outros autores indicam que a subcultura em meios com 2,4-D pode originar malformações morfológicas, como reportado Yang et al. (2011) na embriogénese somática de Schizandra chinensis.
O 2,4-D é o PGR mais importante para a indução de embriogénese somática (Jain et al., 2000; Jiménez, 2005), embora alguma evidência aponte para que promova o desenvolvimento de cotilédones anómalos o que resulta em atrasos na germinação (Hussain et al., 2009). O nível endógeno de hormonas pode ser diferente consoante os explantes usados, da mesma planta e entre espécies diferentes e são fator determinante para o seu potencial embriogénico (Jiménez 2005; Jones et al., 2010; Bathoju e Giri, 2012) e é conhecido que tanto as folhas maduras como jovens têm capacidade para a biossíntese de IAA (Jager et al., 2007). As Apiaceae têm um nível endógeno elevado de fitohormonas (Krens et al., 1997) o que poderá ser influente para uma concentração supraótima quando adicionado o 2,4-D às concentrações já elevadas de auxinas endógenas nos tecidos.
Liu et al. (1993) referem que a auxina é sintetizada no meristema apical do caule e que o transporte polar (Lee e Cho 2006) da auxina é crucial para a regulação de desenvolvimento normal dos cotiledónes; se interrompido este transporte polar pode causar malformações no desenvolvimento dos cotilédones do embrião somático. Tal pode também explicar que a eliminação do 2,4-D do meio de cultura mesmo no meio inicial de indução pode ser vantajoso para o desenvolvimento normal dos embriões e conversão em plântulas (Yang et al., 2011), tal como observado em Distichoselinum onse observou embriogénese somática na ausência de 2,4-D.
No entanto, seguindo um padrão de desenvolvimento da embriogénese in vitro convencional (Canhoto 2010; Sarasan et al., 2006), quando houve transferência do material vegetal do meio com 2,4-D para o meio base MS os embriões somáticos evoluíram para plântulas, em todos os taxa.
Tanto quanto sabemos, esta é a primeira abordagem sobre a micropropagação de Seseli montanum subsp. peixotoanum (Samp.) M. Lainz, um endemismo restrito em Portugal aos solos ultrabásicos de Trás-os-Montes. Esta Apiaceae ibérica é um parente silvestre (CWR) de Seseli libanotis, uma espécie com propriedades medicinais comprovadas (Hawkins et al., 2008; Adams et al., 2009). Aliado ao potencial medicinal e farmacológico, os habitats ameaçados de espécies como Seseli impõem uma maior urgência e prioridade para estudos e experiências de conservação (Hawkins et al., 2008).
As regiões serpentínicas são caracterizadas por solos ultrabásicos e alojam um tipo de flora específico, sendo no geral mais depauperadas em comparação com regiões vizinhas. O "síndrome serpentínico" é um termo que ilustra o conjunto de diferentes componentes químicos, físicos e bióticos e seus efeitos cumulativos, que caracterizam os fatores edáficos a que as plantas nestes habitats se têm de adaptar (Ornduff et al., 2003).
Essas exigências peculiares de adaptação das plantas serpentinícolas podem, eventualmente, contribuir para explicar a resposta in vitro da cultura de Seseli. Numa análise comparativa dos nossos resultados em experiências com outras Apiaceae endémicas cultivadas nas mesmas condições in vitro (Tavares et al., 2010a), os explantes de Seseliforam os mais recalcitrantes e demonstraram diferentes respostas in vitro: - um período de tempo mais longo para a germinação das sementes, bem como dos embriões somáticos; - os rebentos foliares apenas enraizaram em meio com pH 6,2-6,4; as plântulas formadas in vitro apenas superaram a fase de aclimatação após 3-4 meses; a maioria apresentava uma estrutura morfológica muito débil, e facilmente entravam em senescência e morriam. No entanto, a produção de embriões somáticos e de rebentos caulinares, quando otimizadas as condições para a cultura in vitro de Seseli, atingiu valores muito próximos dos de Daucus, o taxon que melhor respondeu in vitro.
Em todos os quatro taxa estudados, a embriogénese somática foi a técnica com a maior taxa de plântulas produzidas, mas os dados avaliados sobre as taxas de regeneração de plantas e sua aclimatação foram inferiores aos obtidos por proliferação de rebentos.
Este processo de apenas uma etapa para a indução da embriogénese somática é interessante porque reduz o tempo de formação de embriões somáticos e de regeneração de plantas. No entanto, parece potenciar a formação de anomalias morfológicas, como também referido em Melia azederach (Vila et al., 2010), bem como a embriogénese secundária e dificulta a separação e a quantificação dos embriões.
Pesquisas laboratoriais anteriores mostraram que a manipulação dos meios de cultura pode aumentar tanto a taxa de indução da embriogénese somática, bem como a tipologia morfológica dos embriões (Canhoto e Cruz, 1994; Brito e Santos, 2009).

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