CONSERVAÇÃO IN VITRO E EX SITU E VALORIZAÇÃO DE ENDEMISMOS IBÉRICOS DAS APIACEAE PORTUGUESAS

Ana Cristina Pessoa Tavares dos Santos

Atividade antifúngica

A atividade antifúngica dos óleos essenciais e de alguns dos seus compostos principais foi avaliada pelo método das macrodiluições contra diferentes estirpes de fungos (de coleção e clínicas) responsáveis por candidíases, infeções respiratórias e dérmicas, de acordo com os protocolos da CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) M27-A3 (CLSI, 2008a), M27-S3 (CLSI, 2008b) e M38-A2 (CLSI, 2008c) para leveduras e fungos filamentosos, respetivamente. 
Foram determinadas a concentração mínima inibitória (CMI) e a concentração mínima letal (CML), sendo estas as concentrações mínimas de óleo essencial que inibem o crescimento dos fungos ou lhes são letais, respetivamente.
As estirpes utilizadas foram as seguintes:
- 6 estirpes de leveduras (Candida albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. guillermondii, C. parapsilosis, Crytococcus neoformans)
- 5 estirpes de dermatófitos (Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, M. gypseum)
- 3 estirpes de Aspergillus (A. niger, A. fumigatus, A. flavus).

As diversas diluições de cada óleo essencial, ou dos seus compostos principais, foram preparadas em DMSO (dimetil sulfóxido), de modo a obter concentrações finais de 0,08 a 20μL/mL. A concentração final de DMSO nunca excedeu 2 %. Culturas recentes de cada estirpe foram utilizadas para preparar a suspensão celular ajustada para 1-2 × 103 células/mL para leveduras e 1-2 × 104 células/mL para fungos filamentosos. A concentração de células foi confirmada pela contagem de viáveis em meio Sabouraud (Sabouraud Dextrose Agar). Os tubos de ensaio foram incubados aerobicamente a 35ºC por 48 h/72 h (Candida spp. e Aspergillus spp./Cryptococcus neoformans) e a 30ºC por 7 dias (dermatófitos). Terminado o tempo de incubação procedeu-se à leitura da CMI.
Para avaliar a CML, plaquearam-se em meio Sabouraud 20 μL de cada tubo em que não se registou crescimento (após a leitura da CMI). Foram depois incubadas por 48 h a 35ºC (Candida spp. e Aspergillus spp.), 72 h para Cryptococcus neoformans e 7 dias a 30ºC (dermatófitos). Além disso, dois antifúngicos de referência, anfotericina B (Fluka) e fluconazol (Pfizer) foram utilizados para controlar a sensibilidade dos microrganismos testados. Todos os testes foram realizados em meio RPMI. Para cada estirpe testada, as condições de crescimento e a esterilidade do meio foram testadas com tubos de controlo. A inocuidade do DMSO também foi verificada na maior concentração testada. Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidas se os resultados diferiam.

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