CONSERVAÇÃO IN VITRO E EX SITU E VALORIZAÇÃO DE ENDEMISMOS IBÉRICOS DAS APIACEAE PORTUGUESAS

Ana Cristina Pessoa Tavares dos Santos

Observação de estruturas secretoras

Para a observação da anatomia das estruturas secretoras, segmentos do pedicelo de flores de plântulas propagadas in vitro de Daucus carota subsp. halophilus foram fixados numa solução aceto-alcool formalina (5:5:90 v/v), embebidos em parafina e as secções (10-12 mm) foram coradas pelo método da safranina verde luz, descrito por Cruz et al. (1990).

Análise dos óleos essenciais

Os óleos essenciais foram analisados pela combinação de técnicas de cromatografia gás-líquido de alta resolução (CGL) e de cromatografia gás-líquido acoplada à espectrometria de massa (CGL-EM).
A CGL analítica foi realizada num cromatógrafo Hewlett Packard 6890 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA USA), equipado com um só injetor e amostrador automático e dois detetores de ionização de chama (DIC). O sistema de injeção foi adaptado para injeção simultânea da amostra em duas colunas capilares, com fases estacionárias de diferentes polaridades. Foram usadas colunas de polidimetilsiloxano com 30 m x 0,20 mm e espessura de filme de 0,20 µm (Supelco SPB-1) e de polietilenoglicol com 30m x 0,20 mm e espessura de filme de 0,20 µm (SupelcoWax 10). Toda a operação do sistema bem como a aquisição e processamento de dados foram realizados por via remota com HP GC ChemStation versão A.05.04. As condições analíticas usadas foram: temperatura do forno programada de 70 a 220ºC, com incremento de 3ºC.min-1, seguido de 15 minutos em condições isotérmicas a 220ºC; temperatura do injetor e detetores de 250ºC; como fase móvel (gás transportador) foi usado hélio em fluxo de 30cm.s-1; injeção em modo split com relação de repartição do fluxo de 1:40.
Para as análises por CGL-EM foram usados cromatrógrafos Hewlett Packard 6890 ou Agilent associados a detetores seletivos de massa Hewlett Packard 5973 ou Agilent 5973N equipados, respetivamente, com coluna capilar de polidimetilsiloxano 30 m x 0,25 mm, espessura de filme 0,25 µm (Hewlett Packard, HP1) e coluna capilar de polietilenoglicol com 30 m x 0,25 mm e espessura de filme 0,25 µm (Agilent, DB-Wax), e também operados por via remota por software Enhanced ChemSation, Hewlett Packard ou Agilent. As condições analíticas utilizadas foram: temperatura do forno programada de 70 a 220ºC, com incrementos de 3ºC.min-1, seguidos de 15 minutos em condições isotérmicas a 220ºC; temperatura do injetor 250ºC; como fase móvel foi usado hélio em fluxo de 30 cm.s-1; injeção em modo split com relação de repartição do fluxo de 1:40; temperatura das interfaces 250ºC; temperatura das fontes de ionização 230ºC; energia de ionização 70 eV; corrente de ionização 0,06 mA; varrimento de massas 35 - 350u.
A identificação dos constituintes dos óleos essenciais resultou da análise combinada de pares de índices de retenção, calculados em fases estacionárias de polaridades distintas e comparados com os de compostos de referência e da interpretação ou comparação de espectros de massa.
Os índices de retenção foram calculados por interpolação linear relativamente aos tempos de retenção de n-alcanos (série homóloga) nas colunas SPB-1 e SPB-Wax.
Para o cálculo e processamento de toda a informação relativa a índices de retenção foram utilizadas as rotinas informáticas RetChron 3.15 (Cavaleiro, 2001). O processamento fundamenta-se na definição de todas as combinações de emparelhamento entre os índices de retenção dos picos cromatográficos resolvidos na coluna apolar e os índices de retenção dos picos cromatográficos resolvidos na coluna polar, com subsequente verificação de cada par por pesquisa automática numa base de índices de retenção de compostos de referência, determinados nas mesmas condições experimentais. Do processamento resulta a sinalização dos pares de índices de retenção compatíveis com os dos compostos integrados na base de dados que, hipoteticamente, poderá indicar a respetiva presença na amostra em análise.
De forma similar, usando as rotinas HP GC ChemStation versão A.05.04, os espectros de massa adquiridos em CGL-EM foram confrontados com os espectros de referência incluídos na base de espectros do laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia de Coimbra e nas bases Wiley275/NIST. Sempre que necessário foram usadas outras fontes de informação da literatura científica e atlas de espectros (Adams, 1995; Joulain et al., 1998).
As indicações de identidade resultantes da análise espectral foram integradas com as hipóteses de identidades determinadas pelos índices de retenção cromatográfica.
De acordo com esta metodologia a identificação de cada composto resultou da conjunção das informações específicas de comportamento de retenção cromatográfica sobre duas colunas com fases estacionárias de polaridade distinta e de padrão de fragmentação por impacto eletrónico a 70 eV revelado no espectro de massa.
A quantificação de cada composto foi determinada com base nas áreas dos picos cromatográficos obtidos por CGL com detetores de ionização de chama. Face aos objetivos do nosso trabalho foi determinada a concentração relativa, pelo método da normalização sem qualquer correção de resposta dos detetores de ionização de chama. Sempre que possível a quantificação foi efetuada a partir dos cromatogramas obtidos com fase estacionária de polidimetilsiloxano. Para os compostos que coeluem nessa fase estacionária a quantificação foi efetuada a partir dos cromatogramas obtidos com fase estacionária de polietilenoglicol.

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