BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS MARINAS (método propuesto)

Medios de cultivos
Agar Luria Bertani (LB)
TCBS
Mac Conkey
S-S
Caldo peptona

Procedimiento
Las técnicas de aislamiento, purificación y preservación de las cepas de bacterias fueron empleados según las recomendaciones descritas por Castañeda et al., 2009.
Paso 1. Recolección de muestras
Las muestras de sedimentos marinos fueron recolectadas con draga metálica tipo Van Veen a 20 cm de profundidad en playas. La muestra fue tomada con un hisopo estéril, rotado en el interior del sedimento, luego inoculado en un tubo previamente estéril  con agua peptona da al 10 % como medio de transporte.Todas las muestras fueron conservadas en refrigeración y transportadas al  laboratorio hasta el proceso de aislamiento.
Paso 2. Aislamiento, purificación y preservación de las cepas bacterianas.
El aislamiento de las bacterias fue realizada mediante la técnica de siembra masiva a partir de asadas tomadas del medio de transporte a medio TSA, posteriormente incubados a 37°C durante 24 horas.
Purificación. Transcurrido el tiempo de incubación las colonias aisladas fueron trasladas a medios selectivos -S-S (Salmonella-Shigella),-TCBS (Vibrios), -Mac Conkey (Enterobacterias), Baird- Parker (Cocos gram positivos) incubadas a 37ºC durante 24horasfinalmente trasladadas a medio LB (Luria Bertani) para posteriores ensayos.
Preservación. Una colonia bacteriana fue transferida a 50 mL caldo LB (Luria Bertani), incubadas a 30ºC durante 12 horas a 120 rpm ajustándose su densidad celular de 0.8 - 1.0 a un O.D de 620 nm. Transcurrido este período de incubación, 720 µL de cada suspensión fue transferido a crioviales con 80 µL de glicerol al 10%, los cuales fueron almacenados a -80ºC. Así mismo, fue implementado como método de conservación a largo plazo la liofilización, manteniéndose cada cepa a -20 °C, en el laboratorio.
Paso 3. Identificación microscópica y bioquímica
Para la identificación microscópica fue empleado la tinción de Gram (bacilos Gram-negativos y cocos Gram positivos), observados en un microscopio Olympus BX41, de acuerdo con las claves taxonómicas del Manual de Bergys y Atlas Microbiológico de Koneman, 2008.
Identificación bioquímica
La actividad metabólica de las bacterias fue determinada empleando el sistema de identificación BBL Crystal™ Kit ID para bacterias Gram negativas no fermentadoras y Gram positivas, siguiendo las indicaciones de la casa comercial y Mostafa et al., 2011. Además fueron realizadas la prueba de Oxidasa, Catalasa, Lactosa y Coagulasa (solo para cocos gram).

Protocolo y condiciones de conservación de las cepas bacterianas
 El diseño y manteamiento de un consorcio de cepas bacterianas aisladas en ambientes naturales, constituye la base de futuras investigaciones en las áreas de la salud, toxicología ambiental y biodiversidad.
1. Conservación en tubo inclinado de agar lb
 Una colonia bacteriana con una densidad celular a 0.5 en la escala de Mc-Farland de las cepas aisladas, fue inoculada en tubos inclinados de agar LB (Luria Bertani), entre 30 y 37 °C durante 24 horas y luego fueron conservados a 4 °C.   
2. Conservacion en glicerol al 10 %
Una colonia bacteriana de 24 horas de incubación fue inoculada en 20 mL de caldo LB con agitación de 120 rpm durante 12-18 horas, hasta alcanzar una densidad celular a 0.6-0.8 (620 nm) en la escala de Mc-Farland. A partir de la suspensión anterior 720 µL fueron transferidos a tubos eppenderf y se le adiciono 80 µL de glicerol al 10 %, se agito con vortex por 10 segundos y luego se refrigero a 4°C y posteriormente a -70 °C.
3. Liofilización
Una colonia bacteriana de 24 horas de incubación fue inoculada en 20 mL de caldo LB con agitación de 120 rpm durante 12-18 horas, hasta alcanzar una densidad celular a 0.6-0.8 (620 nm) en la escala de Mc-Farland. Posteriormente la suspensión bacteriana es liofilizada al vacío y conservadas a – 20 °C.