CONSERVAÇÃO IN VITRO E EX SITU E VALORIZAÇÃO DE ENDEMISMOS IBÉRICOS DAS APIACEAE PORTUGUESAS

Ana Cristina Pessoa Tavares dos Santos

Citometria de fluxo

Seguindo a metodologia descrita por Loureiro et al. (2007a; 2007b), o teor em DNA foi analisado no seguinte material vegetal:
- indivíduos de diferentes populações, das quatro subespécies nativas de Daucus carota (D. carotaL. subsp. carota; D. carota L. subsp. maximus (Desf.) Bal; D. carota L. subsp. gummifer (Syme) Hook. e D. carota L. subsp. halophilus (Brot.) A. Pujadas);
- indivíduos de quatro populações de Eryngium duriaei, em diferentes altitudes (superior e inferior a 1.700m).
O material vegetal fresco, da amostra a estudar (0,5 cm2 de tecido foliar), foi seccionado com uma lâmina afiada, juntamente com 0,5 cm2 de tecido foliar fresco padrão, numa caixa de Petri contendo 1 ml de tampão WPB (0,5 mM C7H19N34HCl, 30 mM de citrato de sódio.3H2O, 20 mM de MOPS, 80 mM de KCl, 20 mM de NaCl, 0,5 % (p/v) de Triton X-100), com o pH ajustado a 7,0, para libertação e manutenção da integridade dos núcleos. Como padrão usou-se Solanum lycopersicon cv. ‘Stupické’ (padrão de referência interno - 2C = 1.96 pg; Doležel et al., 1992) no caso de Daucus carota. Para Eryngium duriaei foi utilizado Pisum sativum, com um padrão de referência com 2C = 8,76 pg.
A suspensão nuclear foi passada através de um filtro de nylon de 50 mm para remover restos de tecido e fragmentos celulares de grandes dimensões. Em seguida, adicionou-se iodeto de propídio (50 mg/mL, PI, Fluka, Suíça) e RNase (50 mg/mL, Sigma, EUA). Após um período de incubação de 5 minutos, a intensidade relativa da fluorescência (FL) de pelo menos 1.300 núcleos G1 por pico foi analisada num citómetro de fluxo CyFlow Partec (Partec GmbH., Münster, Alemanha), utilizando o software FloMax (Partec GmbH). O pico G1 do padrão foi ajustado ao canal 200 e de seguida o sistema de amplificação foi ajustado para uma tensão constante ao longo da experiência. Os histogramas resultantes foram avaliados e o tamanho de genoma de cada amostra foi determinado usando a seguinte fórmula: média FL do pico G1 amostra/média FL do pico padrão G1 x tamanho de genoma do padrão.
O tamanho do genoma foi analisado através do teste one-way ANOVA. As diferenças no tamanho médio do genoma entre populações de cada taxon foram avaliadas usando o teste de Tukey de variação múltipla (SigmaPlot 12.2, SyStat Software).

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