MANUAL DE MÉTODOS ANAL�TICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PAR�METROS FISICOQU�MICOS B�SICOS EN AGUAS

VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DE MÉTODOS

Establecer el procedimiento para la validación o verificación de métodos de ensayo empleados en el área de fisicoquímica de un Laboratorio de Aguas.

7.1. Alcance
Aplica para todos los métodos de análisis que utiliza el laboratorio, según las prioridades de acreditación. Dado que en el laboratorio se aplican rutinariamente diversos métodos, varios de ellos acreditados, a los cuales no se les aplicó este procedimiento anteriormente, la validación o verificación tendrá en cuenta aquella información existente y cuya validez evita repetir la evaluación de alguna(s) variable(s), para poder usar toda la información previa que sea necesaria a la hora de elaborar el informe de validación o verificación.

7.2. Definiciones

Validación:
Confirmación mediante examen y aporte de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso específico previsto de un método analítico.

Verificación:
Aportación de evidencia objetiva de que un elemento satisface los requisitos especificados. El laboratorio debe ser capaz de demostrar que el método es apropiado para resolver la tarea analítica en cuestión.

Especificidad:
Es la habilidad de un método analítico para distinguir el analito a determinar de otras sustancias presentes en la muestra. Los métodos de auto-definición no necesitan ser investigados desde el punto de vista de la especificidad.

Exactitud:
Es la concordancia entre el contenido verdadero de un analito específico en la muestra y el resultado del análisis. En este contexto se entiende por resultado la media de determinaciones duplicadas o un resultado simple, dependiendo de lo que se considere normal para el método. Debe hacerse una distinción entre los diferentes métodos analíticos, sobre la base de si hay o no métodos de referencia disponibles y/o materiales de referencia certificados, así como estudios de ensayos de aptitud.

Intervalo de trabajo o de medición:
Es el intervalo de concentración del analito que reúne los requisitos de calidad del método, experimentalmente demostrado.

Curva patrón:
Refleja la relación entre cantidad/contenido del analito en una solución de muestra y la respuesta de la medición resultante.

Linealidad:
Es la característica de tener una relación proporcional entre el parámetro analizado y el resultado deseado. La transformación matemática se lleva a cabo por medio de una función lineal. Esta función se puede aplicar solamente en un intervalo de concentración limitado, en el cual existe proporcionalidad.

Precisión:
Es el grado de concordancia entre resultados analíticos independientes obtenidos bajo condiciones específicas. La precisión depende solamente de la distribución de los errores aleatorios, y no está asociada con el valor verdadero. Es una característica importante en la evaluación de todos los métodos cuantitativos.

Tabla 7. Tabla expresión de la precisión

Fuente de variabilidad	Repetibilidad	Reproducibilidad interna	Reproducibilidad
Muestra	Igual	Igual	Igual
Analista	Igual	Al menos uno diferente	Diferente
Equipo	Igual		Diferente
Día	Igual		Igual o diferente
Laboratorio	Igual	Igual	Diferente
Condiciones de medición	Iguales	Al menos una diferente	Diferentes

Fuente: Elaboración propia

Debe tenerse presente que la precisión depende mucho de la concentración del analito y de la técnica analítica.

Error:
Diferencia entre un valor medido de una magnitud y un valor de referencia.

NOTA 1:
El concepto de error de medida puede emplearse a) cuando exista un único valor de referencia, como en el caso de realizar una calibración mediante un patrón cuyo valor medido tenga una incertidumbre de medida despreciable, o cuando se toma un valor convencional, en cuyo caso el error es conocido. b) cuando el mensurando se supone representado por un valor verdadero único o por un conjunto de valores verdaderos, de amplitud despreciable, en cuyo caso el error es desconocido.

NOTA 2:
Conviene no confundir el error de medida con un error en la producción o con un error humano.

Error sistemático:
Componente del error de medida que, en mediciones repetidas, permanece constante o varía de manera predecible.

Límite de detección (LD):
Es el contenido de un analito que corresponde a la señal de medición más baja que con cierta confianza estadística puede ser interpretada como un indicador de que el analito está presente solución, pero no necesariamente permitiendo su exacta cuantificación.

Límite de cuantificación (LC):
Es la cantidad más baja de analito en una muestra que puede ser cuantitativamente determinada con cierta confianza.

Concentración a reportar (reporting level):
La más baja concentración dentro de un intervalo operacional de un método, que es considerada bastante confiable, y por lo tanto apropiada para ser reportada. Puede establecerse por mandato regulador, especificaciones del cliente o arbitrariamente con base a un nivel de confiabilidad aceptable. Ejemplos son LD, LC y MCR.

Mínima concentración reportada (MCR):
Es la mínima concentración que puede ser reportada cuantitativamente para un analito en una muestra. No es menor que la concentración del menor patrón de calibración y puede empelarse sólo si este menor patrón, cumple los criterios de calidad.

Robustez:
Es una medida de qué tan bien responde un método analítico ante una implementación no tan perfecta ya que si ciertas etapas del método no se implementan con el suficiente cuidado, pueden tener un efecto severo sobre la efectividad del método. Este parámetro no es objeto de verificación en el laboratorio, por cuanto ya ha sido evaluado para métodos normalizados.

Sensibilidad:
Es una medida de la magnitud de respuesta causada por cierta cantidad del analito.

Selectividad del método:
Un método es selectivo, si puede detectar diferentes componentes presentes en una muestra sin interferencias. Este parámetro no es objeto de verificación en el laboratorio, por cuanto ya ha sido evaluado para métodos normalizados.

Especificidad del método: Un método es específico, cuando la determinación de un analito no es afectada por otras sustancias como reactivos o constituyentes de la matriz. Este parámetro no es objeto de verificación en el laboratorio, por cuanto ya ha sido evaluado para métodos normalizados.

7.3. Procedimiento

7.3.1. Validación de métodos
Los métodos de análisis se deben validar en cualquiera de los siguientes casos:
Métodos no normalizados, Métodos desarrollados por el laboratorio, Métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, Ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados.

Las variables evaluables comprenden:
Especificidad, Precisión expresada como repetibilidad y/o reproducibilidad, Exactitud, Intervalo de trabajo o de medición, Límites de detección y cuantificación, Robustez, Sensibilidad, Selectividad del método y Linealidad. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. Por ejemplo, sensibilidad, selectividad y robustez deben evaluarse sólo cuando se realicen modificaciones en el método.

7.3.2. Verificación de métodos
Se debe verificar el desempeño de los métodos estandarizados o normalizados, los métodos de análisis se verifican en cualquiera de los siguientes casos:

Para verificar que el método es adecuado para su aplicación en el laboratorio, Cuando se incorporan mejoras al método o se amplía su alcance para matrices complejas, Cuando el control de calidad o las pruebas de evaluación de desempeño indican que el rendimiento del método es deficiente, Cuando se reemplacen equipos importantes que puedan afectar la calidad de los resultados, Cuando se realizan cambios en los métodos ya validados y/o verificados y la evaluación de tales cambios, debidamente documentada, indica que se debe verificar su influencia en el método. Cuando se cambia el analista no necesariamente se debe verificar el método de nuevo, sino que se hace una evaluación de desempeño del analista, antes de autorizarle su ejecución rutinaria.

Los parámetros de verificación para cada método dependen del principio físico o químico de la medición, ya que algunas variables no pueden ser cuantificadas porque no aplican o porque no existe un patrón de comparación confiable.

Tabla 8. Tabla parámetros de verificación analítica

Parámetro (Método)	pH (Electrometría)	Conductividad (electrometría)	Alcalinidad (volumetría)	Colorimetría
Intervalo	3-10	X	X	X
Límite de detección			X	X
Exactitud	X	X	X	X
Precisión	X	X	X	X

Fuente: Elaboración propia

7.3.3. Programación de ensayos
Antes de iniciar la etapa experimental, se debe elaborar un plan en que se definan los ensayos a realizar, con el fin de alistar todos los equipos, materiales, insumos, muestras y estándares necesarios para la verificación completa.

Los valores de cantidad o concentración de analito a ser analizados, se establecen con base al intervalo de aplicación del método, los valores usuales de las muestras y la información bibliográfica.

Los ensayos para evaluar precisión y exactitud debenejecutarse más de un día, según la posibilidad de cada método y la estabilidad del analito.

7.3.4. Realización de ensayos

Intervalo de trabajo
La respuesta del método a la concentración no tiene que ser perfectamente lineal para que el método sea eficaz, pero si debe ser repetible cotidianamente. El intervalo de trabajo y el intervalo lineal pueden ser diferentes para diferentes matrices, según el efecto de las interferencias que aporte la matriz. Se hace la diferencia entre intervalo de trabajo e intervalo lineal debido a que algunas metodologías no presentan respuesta lineal a los cambios de concentración. “Preparación, identificación y conservación de reactivos, patrones, muestras internas, curvas de calibración y medios de cultivo”. Los métodos gravimétricos y volumétricos (entre los que se encuentran grasas y aceites y nitrógeno Kjeldahl) no requieren la evaluación de la linealidad, pero si el método se utiliza para determinar muy bajas concentraciones debe hallarse entonces el límite de cuantificación.

Sensibilidad
Para los métodos que tienen un intervalo lineal de respuesta, la sensibilidad equivale a la pendiente promedio de las rectas de calibración obtenidas. La respuesta de algunos métodos se puede linealizar matemáticamente; en estos casos se evalúa la sensibilidad según esta linealización.

Precisión
Depende generalmente de la concentración del analito y el tipo de matriz y se debe determinar para diferentes concentraciones, por ejemplo, a niveles bajo, medio y elevado.

Para la repetibilidad, realizar al menos 3-5 determinaciones individuales de 2 ó 3 muestras de agua similares a las que usualmente se analizan. Y para la reproducibilidad interna, en función de la estabilidad del analito, si es posible, realizar determinaciones en al menos dos o preferiblemente tres días diferentes.
Los ensayos de exactitud y recuperación repetidos bajo las mismas condiciones hacen parte de la evaluación de la precisión.

Como guía de aceptación para la repetibilidad: La cual está basada en la ecuación de Horwitz.

Tabla 9. Aceptación para la repetibilidad

Fuente: Elaboración propia

Exactitud
Dado que el contenido verdadero de la muestra siempre será desconocido, para evaluar este parámetro se depende de normas aceptadas como contenido certificado de un material de referencia (MR), resultados obtenidos utilizando un método validado o un resultado obtenido en un ensayo de aptitud.

Se dispone de un material de referencia certificado (MRC) u otro: si se trata de un material de referencia interno, siempre que sea posible, debe calibrarse contra un material de referencia certificado. Idealmente, el material empleado debe tener una concentración del analito similar al nivel de concentración en las muestras auténticas. Para los métodos en que sea necesario, se analizan blancos y se resta este valor a todos los resultados.

Se calcula el % de error relativo (%E):

%E = (Cexp - Cref) x 100 / Cref

Donde:
Cexp = concentración hallada experimentalmente
Cref = concentración esperada

Y el puntaje Z (Zscore):

Z = (Cexp - Cref) / Sref

Donde:
Sref = desviación estándar del valor esperado

El error admisible y el puntaje Z dependen de diversos factores como el tipo y nivel del analito, la matriz y el método de análisis.

Se dispone de un método de referencia: deben analizarse muestras por ambos métodos en el intervalo de trabajo. Se calcula la regresión lineal con base a los pares de valores de los dos métodos. Una correlación significativa y pendiente cercana a 45°, indican la exactitud del método evaluado.

Se dispone de ensayos de aptitud: tiene la limitante que la exactitud documentada es válida sólo para los niveles de analito y matrices pertinentes.

No se dispone de materiales de referencia ni ensayos de aptitud: se determina el recobrado o recuperación contaminando muestras con cantidades apropiadas de una especie química que contenga el analito en los rangos de concentración específicos de interés. Si el método se utiliza en varios niveles, se deben realizar ensayos de recuperación en, al menos, dos niveles y varias réplicas por nivel. El % de recuperación se calcula:

A)

Donde:
ce = concentración leída de la muestra adicionada con analito
com = concentración original en la muestra (sin analito añadido)
ca = concentración de analito añadido

B)
% recuperación = C real/Cteórica * 100

Donde:
Creal = concentración leída de la muestra adicionada con analito
Cteórica = concentración teórica de la muestra adicionada con analito

El orden de prioridad para evaluar exactitud, va de 1 a 4 pero siempre que sea posible, se recomienda la aplicación combinada de al menos dos de las variantes anteriores.

Límites de detección (LD) y de cuantificación (LC)
Realice el análisis de muestras-blanco y calcule la desviación típica (Sbl) y la media (Xbl) de estos resultados. Para calcular el límite de detección, aplique la fórmula:

LD = Xbl + 3 Sbl

Para calcular el límite de cuantificación, la fórmula:

LC = Xbl + 10 Sbl

Deben analizarse al menos 7 blancos y en los casos que el analito es determinado utilizando una curva patrón, los límites son calculados a partir de ésta. El concepto de límite de detección aplica generalmente para métodos espectrofotométricos, cromatográficos y algunos electrométricos; no siempre es aplicable para métodos volumétricos ni gravimétricos. El concepto de límite de cuantificación aplica para la mayoría de métodos de ensayo, aunque no siempre es aplicable para métodos de medición físicos. Para los métodos en que no sea aplicable el concepto de límite de detección, se adopta la definición de límite de cuantificación con un criterio de aceptación particular, basado en valores máximos aceptables de precisión, exactitud y/o incertidumbre.

7.3.5. Otras variables aplicables para validación de métodos
Los siguientes parámetros no se evalúan usualmente en la verificación de métodos normalizados, pero sí son de aplicación para las validaciones como tal. La información proporcionada a continuación es solamente ilustrativa, porque en estos casos se deben definir y aplicar diseños experimentales estadísticos multivariados.

Confirmación de identificación, selectividad y especificidad.

La identidad se establece cuando la señal producida en la etapa de medición puede ser atribuida únicamente al analito y no a la presencia de algo similar o la coincidencia.

La selectividad y la especificidad evalúan la confiabilidad de las mediciones ante la presencia de interferencias; la especificidad se considera por lo general como un 100% de selectividad.

La selectividad puede estar afectada por la existencia del analito en más de una forma (libre, enlazado o en diferentes estados de oxidación, por ejemplo). Las interferencias pueden disminuir o aumentar la señal atribuida al analito. Si no se sabe sobre la existencia o no de interferencias, se puede valorar la selectividad del método por comparación con la aplicación de otro método.

Para cuantificar estas variables, cuando sea necesario, se pueden realizar ensayos como:

• Análisis de muestras y materiales de referencia mediante dos o más métodos, para confirmar si el método es capaz de medir el analito separadamente de otras interferencias.
• Análisis, por métodos como la adición estándar, muestras que contengan el analito y algunas interferencias y establecer cómo éstas influyen en la cuantificación del analito.

La selectividad de un método se estudia adicionando a una muestra las interferencias que se crea tengan mayor probabilidad de estar presentes en las muestras.

Robustez, cuando se requiera validar modificaciones de métodos, se realizan variaciones deliberadas en las etapas o factores críticos del método y se cuantifica el efecto en el rendimiento, antes de entrar en estudios de colaboración.

7.4. Informe final
Una vez terminada la verificación, el analista encargado elabora un informe con los resultados del proceso, para ser aprobado por el Jefe de Laboratorio mediante la firma de la declaración de conformidad del método.

El informe debe ser concreto e incluir, por lo menos:

• Objetivo: “confirmar que el método… es adecuado para el análisis de muestras de…”
• Alcance: parámetros que serán evaluados.
• Recursos: hacer referencia a la Instrucción de Ensayo correspondiente donde aparecen relacionados entre otros, los equipos de medición, los reactivos y los estándares y otros materiales o insumos utilizados. Puede hacerse énfasis en los que tienen un efecto significativo sobre los resultados.
• Procedimiento: hacer referencia a la Instrucción de Ensayo correspondiente. De considerarse relevante puede hacerse una explicación resumida de algún aspecto que lo amerite.
• Resultados y cálculos: tablas debidamente organizadas que incluyan un resumen de los resultados de los ensayos, antes y después del rechazo de datos; en esas mismas o en otras tablas se pueden incluir los resultados de los cálculos estadísticos.
• Análisis de resultados: se incluye la especificación de los requisitos que debe cumplir el método; se hace una explicación, cuando sea relevante, de lo que significan los valores obtenidos en la verificación; no se deben incluir frases que repitan lo dicho en el procedimiento sino explicaciones que aporten valor agregado al documento.
• Conclusiones: se concluye que se ha verificado que el laboratorio puede cumplir los requisitos al usar el método; puede incluirse una tabla en que se resuman los resultados estadísticos del proceso de verificación del método.
• Declaración de conformidad: “de acuerdo a los resultados obtenidos, el método… se ajusta al uso propuesto…”; puede ser la conclusión final.

El informe debe incluir todas las especificaciones y detalles a que haya lugar para la correcta comprensión del documento sin necesidad de explicaciones verbales. Cuando la verificación sea satisfactoria, el Jefe del Laboratorio firma la declaración de conformidad; en caso contrario no lo hace hasta que tal declaración sea verdadera.

Bibliografía

• Cortés, C. 2010. Validación de métodos. Docto. No. MP-CA005-02 Entidad Mexicana de Acreditación (EMA). México.
• Cortés, C. y García, R. 2009. Validación con base en los criterios de aplicación de la norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 en mediciones químicas y físicas. Entidad Mexicana de Acreditación. México, DF.
• Cortes, G. 1999. Lineamientos para el control de calidad analítica. Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales IDEAM. Colombia.
• Norma Técnica Colombiana NTC-ISO 3650-1”Calidad del agua. Vocabulario. Parte 1. 2010-07-28