Seseli montanum subsp. peixotoanum

Sementes deSeseli montanum subsp. peixotoanum foram recolhidas de plantas em habitat natural . Seguindo a metodologia descrita, segmentos foliares e o ápice caulinar foram utilizados para a embriogénese e proliferação de meristemas in vitro em meios suplementados com 2,4-D (0-2mg/L) e com BA (0-2 mg/L), respetivamente.

Proliferação de meristemas

Decorridas quatro semanas de cultura do ápice caulinar os resultados indicaram que a média de proliferação de rebentos formados, nos dois ciclos de 30 dias de cultura, aumentou com o aumento da concentração de BA (Tabelas 26 e 27) Relativamente ao primeiro conjunto de experiências foi atingido um máximo de 4,5 rebentos por explante, no meio contendo BA com a concentração de 2 mg/L (Tabela 26).
Num segundo conjunto de experiências, e após a remoção de todos os rebentos para enraizamento, a parte basal do explante (stump) foi inoculado novamente no mesmo meio de cultura para um novo ciclo de multiplicação. O número de rebentos caulinares produzidos foi mais elevado nesta segunda fase de cultura , em todos os meios testados. O valor médio máximo (7,2 rebentos por explante) foi encontrado para a concentração de 2mg/L BA e o menor (2,6 rebentos por explante) foi observado usando a menor concentração de BA (0,1 mg/L) (Tabela 27).
A formação de um calo organogénico ocorreu na zona de corte do explante , dando origem a rebentos adventícios, o que contribuiu para o aumento do número total de rebentos formados.
Os rebentos caulinares puderam enraizar depois de transferidos para meio base MS, apenas quando o pH foi aumentado para valores entre 6,0-6,4. As plântulas obtidas eram morfologicamente idênticas às plantas silvestres

Tabela 26: Efeito da concentração de BA sobre a proliferação de rebentos em ápices caulinares de Seseli montanum subsp. peixotoanum, após4 semanas de cultura.

*Cada valor é a média com erro padrão de três réplicas.

Tabela 27: Efeito da concentração de BA sobre a proliferação de rebentos em ápices caulinares de Seseli montanum subsp. peixotoanum, num segundo ciclo de proliferação.

*Cada valor é a média com erro padrão de três réplicas.

Enraizamento e aclimatação ex situ

Os rebentos caulinares (2-3 cm) foram isolados e transferidos para meio MS sem reguladores de crescimento. A formação de raízes foi observada apenas em meio MS com pH ajustado para 6,2-6,4. De seguida as plantas foram retiradas dos tubos, limpas e mantidas em água para aclimatação durante uma semana, antes de serem transferidas para vasos e instaladas no fitotrão. Cerca de 40% das plântulas sobreviveram (10 em 23) e foram posteriormente transferidas para viveiro .

Embriogénese somática

De acordo com os procedimentos descritos, os segmentos foliares (0,5-1 cm) provenientes da germinação in vitro das sementes de Seseli montanum subsp. peixotoanum colhidas em habitat natural ( foram cultivados em meio MS contendo 2,4-D (0,1, 1 e 2 mg/L 2,4-D). Os explantes cultivados nestas condições produziram calos embriogenéticos (Fig. 48a) decorridos 4 meses de cultura (Tabela 28). A maior percentagem de calos (63%) foi produzida no meio com 2 mg/L, registando-se a menor percentagem na menor concentração de 2,4- D (Tabela 28).
Os calos nodulares foram repicados para meios com igual composição, onde os primeiros embriões somáticos se formaram no meio 0,1 mg/L de 2,4-D, decorridos 4 meses de cultura. Nesta altura, avaliou-se a formação de embriões somáticos em todos os meios.
No meio com a concentração de 0,1 mg/L de 2,4-D formaram-se, em oito tubos de ensaio (equivalente a 8 amostras de calo) uma média de 31 embriões somáticos; no meio com 1 mg/L 2,4-D apenas se formaram, no total, 28 embriões (Tabela 28); no meio com 2 mg/L de 2,4-D não houve registo de embriões somáticos no mesmo período de cultura (Tabela 28).
 Nas culturas em meios com 0,1 ou 1mg/L de 2,4-D, os embriões somáticos foram transferidos para meio com MS, para desenvolvimento dos embriões ; os calos nodosos, com possíveis embriões ainda incipientes, do meio com 2 mg/L 2,4-D foram subcultivados no mesmo meio. Decorridos 3 meses de cultura foram produzidas 66 plântulas no meio com 1 mg/L e 282 plântulas no meio com 0,1 mg/L (Tabela 29), como se descreve de seguida.
Foi feita uma extrapolação baseada no número de embriões germinados a partir dos calos iniciais após 4 meses de cultura. Assim, o meio de indução com a menor concentração de 2,4-D (0,1 mg/L) foi o mais eficaz e produziu a maior profusão de embriões somáticos em menos tempo (Tabela 28), tendo sido por isso para a estimativa do potencial embriogénico.

Tabela 28: Embriogénese somática em segmentos foliares de Seseli montanum subsp. peixotoanum, sob a ação de diferentes concentrações de 2,4-D.

Avaliou-se o processo de indução em oito amostras, encontrando uma média de 31 embriões (por tubo/calo) após 4 meses de cultura. Seguimos, durante 3 meses a evolução do material repicado para meio sem hormona, das séries correspondentes a 3 tubos de ensaio, que contabilizámos. Calculámos uma média dos valores nestes 3 casos que utilizámos para estimar os valores de indução (Tabela 29).

Tabela 29: Estimativa de plântulas produzidas por embriogénese somática em segmentos foliares de Seseli montanum subsp. peixotoanum, cultivados in vitro em 0,1 mg/L 2,4-D

Estas contagens e estimativas pretenderam aproximar os valores esperados para valores corrigidos pela extrapolação feita. Assim, em média, podem ser produzidas cerca de 28 plântulas (Tabela 29), decorridos 7 meses de cultura, de cada tubo de ensaio e amostra de calo embriogénico onde se produziram embriões somáticos. Embora não tenha havido pesagens das amostras dos calos como em Daucus, as dimensões eram idênticas às de Daucus (0,29 mg),
Observou-se, nalguns casos, a produção de grande quantidade de embriões somáticos na mesma amostra de material vegetal .
Os embriões somáticos desenvolveram-se ainda no meio com 2,4-D e foram depois transferidos para um meio sem auxina, onde decorridos 3 meses de cultura, originaram plântulas , que foram preparadas para envasamento de seguida..
As plântulas formadas eram muito finas e pequenas pelo que foram submetidos a um período mais longo de germinação em meio base sem o que rapidamente necrosavam, em especial no sistema radicular. Todos os meios tinham a particularidade do pH ajustado a valores entre 6,2- 6,4. Cerca de 50% das plântulas formadas foram envasadas em boas condições (10 plantas em 20).

As plântulas produzidas in vitro por embriogénese somática e por proliferação de meristemas foram aclimatadas em condições de exterior nos viveiros e nos terraços da escola médica do Jardim Botânico da Universidade de Coimbra , onde um exemplar já produziu flor e fruto .

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