POTENCIAL DE USO EM RECUPERAÇÃO DE ÁREAS DEGRADADAS

Yvens Ely Martins Cordeiro

3.5.2 Variáveis bioquímicas

Amostras para a determinação dos teores foliares de sacarose, prolina, carboidratos solúveis totais, aminoácidos solúveis totais, amido, proteínas solúveis e glicina-betaína, foram coletadas a partir de folíolos completamente maduros, do segundo par de folhas definitivas e completamente expandidas contadas a partir do ápice. Os folíolos foram destacados da plantas nos mesmos horários em que foram conduzidas as medições de trocas gasosas e imediatamente acondicionados em sacos de papel e levados à estufa de ventilação forçada para completa secagem, a qual foi realizada a 72 oC, por 72 h. Após a secagem, os mesmos foram triturados a pó fino e armazenados em frascos hermeticamente fechados encerrados em um dessecador até o momento da análise.
Os teores de sacarose foram determinados utilizando-se o método proposto por Van Handel (1968). Para a extração, amostras de 30 mg de massa seca foliar foram homogeneizadas em 1,5 mL de solução de MCW (metanol, clorofórmio e água; 12:5: 3v/v/v), durante 30 minutos, e posteriormente centrifugada a 3500 rpm, por 30min, à temperatura ambiente. Após a coleta do sobrenadante, reservado em um tubo de ensaio em separado, uma extração do resíduo resultante foi realizada, seguindo as mesmas condições supracitadas. O novo sobrenadante foi coletado e reunido ao primeiro. Em seguida, realizou-se a separação de fases do solvente extrator, de modo que a cada 2,0 mL do extrato final foram adicionados 0,5 mL de clorofórmio e 0,75 mL de água destilada. A mistura foi submetida à centrifugação a 2000 rpm, por 10 min. Das fases resultantes, coletou-se a fração aquosa metanólica (superior), transferindo-se a mesma para tubos de ensaio com rosca e submetendo-os a incubação em banho-maria a 35oC, por 40 min, para a evaporação do clorofórmio residual. A quantificação das amostras foi realizada tomando-se alíquotas de 0,1 mL das mesmas e adicionando 0,1 mL de KOH 30%. Após vigorosa agitação, a mistura foi aquecida a 100oC por 10 min e, após resfriamento, foi imediatamente adicionado 3,0 mL de solução de antrona 0,2%, em ácido sulfúrico concentrado. A mistura foi agitada e incubada a 40 oC, por 20 min. Após resfriamento, obteve-se a absorvância das mesmas, a 620 nm, utilizando-se um espectrofotômetro UV-Visível (mod. GenesysTM 10series, Marca Thermo Electron Corporation, Wisconsin, USA). Para os cálculos, uma curva padrão de sacarose foi preparada e os resultados foram expressos em mg de sacarose/ g Matéria Seca (MS).
Os teores de prolina foram determinados de acordo com Bates et al. (1973). A extração foi realizada a quente (em banho-maria a 100 °C, por 30 min), homogeneizando amostras de 50 mg do material vegetal seco em 5 mL de água destilada. Após centrifugação a 1000 rpm, por 20 min, o sobrenadante foi coletado e deste utilizado uma alíquota de 1 mL para a quantificação de prolina. Para esta operação, foi adicionado 1 mL de ninhidrina ácida e 1 mL de ácido acético glacial (99,5%), seguindo-se de agitação e incubação a 100 oC, por 1 h. Após o desenvolvimento da cor, as mostras foram resfriadas em banho de gelo, sendo adicionadas às mesmas 2 mL de tolueno para a separação das fases. Desprezando a fase incolor, a leitura das amostras da fração contendo grupo cromóforo foi realizada em espectofotômetro UV-Visível (mod. GenesysTM 10series, Marca Thermo Electron Corporation, Wisconsin, USA), a 520nm. A concentração de prolina foi determinada por meio de uma curva de calibração de prolina e o resultado expresso em mmol prolina/ g MS.
Os carboidratos solúveis totais foram extraídos a quente (30 min a 100 ºC), em amostras de 50 mg de matéria seca homogeneizadas em 5 mL de água destilada. As amostras foram centrifugadas a 2000 rpm, por 10 min, e o sobrenadante coletado para a obtenção do extrato total. Deste, foram tomadas alíquotas de 20 µL por amostra e a elas adicionadas 480 µL de água destilada e 500 µL de fenol 5%. Após vigorosa agitação, foi adicionado, de maneira uniforme e de uma única vez no centro do tubo, 2,5 mL de H2SO4 concentrado. Os tubos foram agitados e após 20 min de repouso à temperatura ambiente obteve-se a absorvância da amostra a 490 nm (DUBOIS et al., 1956). Para os cálculos foi utilizada curva-padrão de glicose e os resultados expressos em mmol glicose g-1 MS.
As proteínas solúveis totais foram extraídas do resíduo resultante da extração dos carboidratos solúveis foi adicionado 5 mL de NaOH a 0,1 N, para a extração dos TPS. Em seguida foi misturado e centrifugado a uma mesma rotação e tempo utilizados para carboidratos. Uma nova extração com 5 mL de NaOH a 0,1% e centrifugação foram realizados. Do sobrenadante, foram retirados 0,1 mL e acrescentado 5 mL do reagente de Breadford. (100mg de Comassie Blue/50mL de etanol 95%). Após 15 min foi feita a leitura em um espectrofotômetro Micronal modelo B442 no comprimento de onda de 595 nm (BRADFORD, 1976).
Para os teores de glicina-betaína foram retiradas amostras de 25 mg de massa seca liofilizada foi colocada no shacker a 25° C (extração a frio); centrifugar a 10000 rpm por 10 min a 25° C;  o sobrenadante para obtenção do extrato aquoso. Em eppendorfs de 2 ml foi adicionado 250 µL do extrato aquoso + 250 µL de H2SO4 2 N ( diluição da amostra 1:2); os eppendorfs devem permanecer durante 1 hora no banho de gelo ( na geladeira – de 0º C a 4º C); em seguida, adicionar 200 µL de KI-I2 gelado; manter durante 16 horas a 0° C (banho de gelo na geladeira – de 0º C a 4º C); centrifugar durante 15 min, 10000 rpm, 0° C. Descartar o sobrenadante; lavar o preciptado 2 vezes com 2 ml de H2SO4 1n gelado com centrifugações por 5 min, 10000 rpm, 0°C a cada lavagem ( não agitar enquanto estiver lavando); após as lavagens, dissolver o preciptado em 3 ml de 1,2-dicloroetano agitando vigorosamente; realizar diluições 1:6 (diluição para a curva)ou testar outras maiores (1:12, 1:24,ou 1:48 para as amostras- a diluição vai depender da quantidade de glicina-betaína precipitada); após 2 a 2,5 hora de descanso, realizar a leitura em espectrofotômetro (GRIEVE e GRATTAN, 1983).
Para a extração do amido, amostras de 50 mg de matéria seca foliar, homogeneizadas em 5,0mL de etanol 80%, foram incubadas em banho-maria, por 30 min, a 80 oC. Após centrifugação por 10 min, a 2000 rpm, o sobrenadante foi coletado e reservado em um novo tubo. Do resíduo da extração etanólica procedeu-se nova extração, porém, utilizando-se 5,0 mL de HClO4 30%, seguindo de incubação a 25 oC, por 30 min. Uma nova centrifugação similar a anterior foi realizada e o novo sobrenadante foi coletado e reunido ao primeiro, sendo o volume final ajustado para 10 mL com água destilada. Em seguida, alíquotas de 20 µL do extrato final foram misturadas a 480 µL de água destilada e submetidos à agitação por 15 min. Foi adicionado 0,5 mL de fenol 5%, procedendo-se nova agitação por igual tempo. Por fim, foi adicionado, de uma única vez no centro do tubo, 2,5 mL de H2SO4 concentrado, seguindo-se de agitação vigorosa por 15 min. Após repouso por 20 min, à temperatura ambiente, a absorvância das amostras foi obtida a 490 nm (DUBOIS et al., 1956). Para a quantificação do amido foi utilizada uma curva padrão de glicose e os resultados expressos em μg glicose/ g MS.
Para quantificação de aminoácidos solúveis totais foram utilizados 30 mg de massa seca foliar, adicionou-se 15 mL de água destilada seguido de incubação por 30 min a 100ºC. Após centrifugação a 1000 rpm por 10 min para obtenção do extrato total. Em seguida alíquotas de 30 µL do extrato e foram misturados a 470 µL de água destilada. Em seguida acrescentou-se 250 µL do tampão citrato (0,2 M e pH 5,0) e 250 µL do reagente ninhidrina. Seguindo-se de agitação por 10 min e uma nova incubação por 15 min. a 100ºC. Os tubos foram resfriados e adicionado 1,5 mL de etanol 50% e após 20 min de repouso, à temperatura ambiente, a absorvância das amostras foi obtida a 570 nm (PEOPLES et al.,1989). Para a quantificação de açucares solúveis totais foi utilizada uma curva padrão de glutamina e os resultados foram expressos em μmol de AA/ g MS.

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